در این مقاله سعی داریم شما را با انواع آزمایش ها بر روی قهوه رست شده و دانه قهوه آشنا سازیم. این دسته آزمایشات بر روی قهوه در بخش آزمایشگاه مواد غذایی یکی از زیر مجموعه های مجتمع آزمایشگاهی رادگستر قرار دارد.
آزمایش های قابل انجام بر روی قهوه:
- آزمایش میزان کافئین
- آزمایش طعم ٬ رنگ ٬ بو ٬ رطوبت قهوه
- آزمایش خاکستر
- آزمایش میزان قلیایی بودن قهوه
- آزمایش مواد محلول در آب قهوه
- آزمایش عصاره اترین
- آزمایش آفات
- آزمایش باقی مانده سموم
در ابتدا شما را با آزمایش تعیین میزان کافئین قهوه آشنا میسازیم.
معرفی قهوه
قهوه یکی از محبوب ترین نوشیدنی ها در جهان است. قهوه در انواع و اقسام سنتی و لذیذ متعدد و مخلوط و در اشکال مختلف از جمله دان کامل، آسیاب شده، فوری و نوشیدنی های آماده موجود است. همچنین برای دم کردن در خانه در بسته‌های مختلف از جمله بسته‌های تک‌نفره مانند بسته‌های قهوه فوری و فنجان‌های دم‌آوری موجود است و به عنوان یک ماده در سایر محصولات استفاده می‌شود.
آزمایش میزان کافئین قهوه با دستگاه HPLC
هدف، واقعگرایانه:
مطالعه حاضر به منظور توسعه و تایید یک روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس برای تعیین کافئین از مواد دانه‌های قهوه عربیکا مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها:
جداسازی در یک ستون C18 فاز معکوس با استفاده از یک فاز متحرک متشکل از آب: متانول (50:50) با سرعت جریان 1.0 میلی‌لیتر در دقیقه به دست آمد. تشخیص بر روی یک آشکارساز UV در 272 نانومتر انجام شد. روش توسعه‌یافته با توجه به الزامات دستورالعمل‌های کنفرانس بین‌المللی هماهنگ‌سازی (ICH)، که شامل ویژگی، خطی بودن، دقت، دقت، محدودیت تشخیص و محدودیت کمی است، اعتبارسنجی شد.
نتایج:
روش توسعه‌یافته خطی بودن خوب را با ضریب همبستگی عالی تأیید می‌کند (R2 > 0.999). در تکرارپذیری و دقت متوسط، درصد انحراف استاندارد نسبی (% RSD) سطح پیک کمتر از 1% بود، دقت بالای روش را نشان می‌دهد. میزان بازیابی کافئین در محدوده 98.78٪ – 101.28٪ بود که نشان دهنده دقت بالای روش است. حد پایین تشخیص و حد کمی کافئین، تشخیص و اندازه‌گیری کافئین از C. arabica را در غلظت‌های پایین امکان‌پذیر می‌سازد.
نتیجه:
روش HPLC توسعه یافته یک روش ساده، سریع، دقیق، دقیق و به طور گسترده پذیرفته شده است و برای سنجش کارآمد در کارهای معمول توصیه می شود.
خلاصه آزمایش کافئین در قهوه
یک روش ساده، دقیق و حساس کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) برای کافئین از Coffea arabica توسعه و تایید شده است. روش HPLC توسعه‌یافته برای خطی بودن، ویژگی، دقت، بازیابی، محدودیت‌های تشخیص و محدودیت‌های کمی توسط کنفرانس بین‌المللی دستورالعمل‌های هماهنگ‌سازی تایید شد. نتایج نشان داد که روش پیشنهادی از پایایی بالایی برخوردار است. این روش می تواند با موفقیت برای تجزیه و تحلیل معمول کیفیت کار استفاده شود.
مخفف مورد استفاده: C. arabica: Coffee arabica، ICH: کنفرانس بین المللی هماهنگ سازی، % RSD: درصد انحراف استاندارد نسبی، R2: ضریب همبستگی، ppm: قطعات در میلیون، LOD: محدودیت های تشخیص، LOQ: محدودیت های کمیت، SD: انحراف استاندارد، S: شیب، RP-HPLC: کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس، v/v: حجم در حجم.
در سال های گذشته افراد با بیماری های مختلفی مواجه بودند و به طور مداوم از گیاهان دارویی برای درمان همه بیماری ها استفاده می شود. امروزه طب گیاهی به دلیل مسمومیت و عوارض جانبی ناخواسته به عنوان درمان مکمل و جایگزین در ترکیب با درمان های خط اصلی پذیرفته شده است.[1] داروهای گیاهی از ترکیبات گیاهی مختلفی تشکیل شده‌اند که فعالیت‌های دارویی را از بین می‌بردند.[2]
گونه های قهوه به خوبی در سراسر جهان شناخته شده و گسترده هستند. از خانواده Rubiaceae است. بیش از 120 گونه قهوه در سراسر جهان شناسایی شده است.[3] گونه های اصلی قهوه قهوه عربیکا (قهوه عربیکا) هستند که 70 درصد از کل بازار قهوه را به خود اختصاص می دهند و Coffea canephora (قهوه روبوستا) بقیه را تشکیل می دهد.[4]
ترکیبات گیاهی اصلی C. arabica حاوی کافئین، یک آلکالوئید، [5] اسید کلروژنیک، یک ترکیب پلی فنلی، [6] کاروتنوئیدها، [7] و آنزیم ها هستند. C. arabica به عنوان آنتی اکسیدان، [9] ضد سرطان، [10] محافظ کبد، [11] ضد التهاب، [12] محرک ایمنی، [13] ضد دیابت، [14] ضد باکتری، [15] و ضد ویروس گزارش شده است.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس (RP-HPLC) شامل جداسازی مولکول ها بر اساس آب گریزی است. بررسی ادبیات گسترده نشان داد که روش های کمی برای تخمین کافئین توسط RP-HPLC گزارش شده است. از این رو، تلاشی برای توسعه سریع و تایید یک روش جدید، ساده، دقیق، دقیق، و مقرون به صرفه RP-HPLC برای تعیین کمیت کافئین در C. arabica انجام شده است.
مواد و روش ها
استاندارد کافئین (99.8٪) از سیگما آلدریچ (هند) به دست آمد. تمامی معرف ها و حلال ها از نوع آنالیتیکی و درجه HPLC بودند. مواد لوبیا C. arabica از شرکت بازرگانی Sargod، Chikmagalur، Karnataka، هند تهیه شده است.
تهیه عصاره
عصاره هیدروالکلی دانه قهوه با استخراج سوکسله از 500 گرم پودر دانه قهوه C. arabica با استفاده از اتانول 70 درصد در دمای 75 درجه سانتی گراد در چهار دسته متوالی تهیه شد. استخراج دسته ای اول با افزودن 800 میلی لیتر حلال به مدت 3 ساعت و سه عصاره گیری متوالی با افزودن 500 میلی لیتر در هر دسته به مدت 3 ساعت انجام شد. پس از اتمام استخراج، مایع استخراج شده با تبخیر در اواپراتور چرخشی، با بازده تقریبی 15 درصد وزنی بر وزنی، تغلیظ شد.
ابزار دقیق و شرایط کروماتوگرافی
HPLC بر روی یک سیستم Shimadzu LC2030 C Prominence I (ژاپن) مجهز به یک پمپ حلال تحویل گرادیان کم فشار چهارتایی LC2030 با دریچه‌های سوئیچینگ فشار بالا، واحد گاززدایی آنلاین LC2030، یک آشکارساز فرابنفش (UV) با حساسیت بالا LC2030، انجام شد. نمونه‌بردار خودکار LC2030 با سرعت درایو با یک حلقه 100 میکرولیتری، و 216 نمونه را در یک زمان با سیستم قفسه دسترسی مستقیم و اجاق ستونی با ظرفیت بالا در خود جای می‌دهد. سیستم کنترل و داده ها توسط نرم افزار LabSolutions تجزیه و تحلیل شد. قبل از انتخاب شرایط کروماتوگرافی، تعدادی آزمایش با نسبت‌های مختلف حلال، سرعت جریان و دما برای بررسی زمان ماند (RT)، شکل پیک، فاکتور باطله (تقارن اوج)، و صفحات نظری آنالیت انجام شد. جداسازی در ستون Kinetex C18 (100A0، 150 × 4.6 میلی متر، اندازه منافذ 5 میکرومتر) انجام شد. فاز متحرک شامل شستشوی ایزوکراتیک با گرادیان فشار کم با استفاده از آب دوبار مقطر: متانول (A:B): (50:50) با سرعت جریان 1.0 میلی لیتر در دقیقه و حجم تزریق 5 میکرولیتر است. تمام محلول ها گاز زدایی شده و از طریق فیلتر اندازه منافذ 0.2 میکرومتر فیلتر شدند. ستون در طول تجزیه و تحلیل در دمای 26 درجه سانتیگراد نگهداری شد و آشکارساز UV روی 272 نانومتر تنظیم شد. حدود 70 درصد متانول به عنوان رقیق کننده برای سنجش با استفاده از آنالیز HPLC استفاده شد و کل زمان اجرای LC 5 دقیقه بود. ابزار قبل از تجزیه و تحلیل کالیبره و واجد شرایط شد. با استفاده از این شرایط کروماتوگرافی، می توان RT کافئین را با تزریق استاندارد مربوطه به طور جداگانه تأیید کرد. علاوه بر این، پارامترهای تناسب سیستم مانند فاکتور باطله (T) و صفحات نظری (N) به محلول استاندارد کافئین (100 ppm) محاسبه می‌شوند.
تهیه محلول استاندارد مقادیر مشخصی از استاندارد مرجع کافئین که به طور دقیق وزن شده بود مخلوط و در متانول 70 درصد در یک فلاسک حجمی 100 میلی لیتری حل شد تا محلول ذخیره 100ppm به دست آید. قبل از تجزیه و تحلیل، محلول از طریق فیلترهای غشایی نایلونی 0.20 میکرومتر فیلتر شد.
تهیه محلول نمونه عصاره دانه قهوه خشک شده در متانول 70 درصد برای دستیابی به غلظت نهایی ppm 100 تهیه شد. قبل از تجزیه و تحلیل، محلول از طریق فیلترهای غشایی نایلونی 0.20 میکرومتر فیلتر شد.
تهیه محلول نمونه میخ دار سه حجم مختلف (2، 4، 6 میلی لیتر) محلول استوک استاندارد و 1 میلی لیتر محلول نمونه (100 پی پی ام) به طور جداگانه به 10 میلی لیتر فلاسک حجمی اضافه می شود. محلول استوک استاندارد برای تعیین بازیابی به نمونه وارد شد. قبل از تجزیه و تحلیل، محلول ها از طریق فیلترهای غشایی نایلونی 0.20 میکرومتر فیلتر شدند.
اعتبار سنجی روش اعتبار سنجی روش تحلیلی توسعه یافته بر اساس دستورالعمل های کنفرانس بین المللی هماهنگ سازی (ICH) انجام شد.[17] این روش برای ویژگی، خطی بودن، بازیابی، دقت، و محدودیت های تشخیص (LOD) و محدودیت های کمی سازی (LOQ) تایید شده است.
ویژگی ویژگی یک روش با آزمایش مواد استاندارد در برابر تداخل بالقوه تعیین شد. با تزریق شش تکرار محلول آزمایشی 100% (نمونه) نشان داده شد.
خطی بودن خطی بودن با غلظت های مختلف شناخته شده محلول استاندارد کافئین در سه تکرار با رقیق کردن محلول ذخیره استاندارد تعیین شد. برای تعیین خطی بودن، پنج مقدار کمی از محلول استوک استاندارد (یعنی ppm 100) پیپت شد. 2-10 میلی لیتر از محلول استوک استاندارد در یک سری فلاسک های حجمی 10 میلی لیتری پیپت شد و حجم با حلال تکمیل شد تا غلظتی از 20 ppm تا 100 ppm کافئین به دست آید. منحنی کالیبراسیون با ترسیم نواحی پیک در برابر غلظت ساخته شد و معادلات رگرسیون خطی محاسبه شد. ضریب همبستگی نیز محاسبه شد.
دقت دقت با مطالعه تکرارپذیری (داخل روز) و دقت متوسط (بین روز) تعیین شد. تکرارپذیری و دقت متوسط روش با محاسبه درصد انحراف استاندارد نسبی (% RSD) سه سطح غلظت مختلف کافئین استاندارد 20، 40 و 60 ppm تعیین شد. تکرارپذیری در همان روز مورد بررسی قرار گرفت، در حالی که دقت متوسط در روزهای مختلف توسط تحلیلگرهای مختلف مورد بررسی قرار گرفت.
نتیجه
روش HPLC توسعه یافته یک روش ساده، سریع، دقیق، دقیق و به طور گسترده پذیرفته شده است و برای سنجش کارآمد در کارهای معمول توصیه می شود. بنابراین، این روش برای تعیین کافئین، آلکالوئید در C. arabica مناسب است. اکتشافات بیشتر برای بررسی استانداردسازی ترکیبات گیاهی فردی C. arabica مورد نیاز است.
