تعیین جنسیت پرندگان به روش PCR در اصفهان یکی از خدماتی است که در آزمایشگاه دامپزشکی رادگستر انجام میشود. در ادامه توضیحات کامل این نوع روش برای تعیین جنسیت پرندگان زینتی به شما ارایه میشود. با ما همراه باشید.

بسیاری از گونه های پرندگان از نظر جنسی تک شکلی در نظر گرفته می شوند. در گونه های پرنده تک شکل، به ویژه در پرندگان جوان، تشخیص جنسیت بر اساس تجزیه و تحلیل مورفولوژی خارجی آنها دشوار است. شناسایی دقیق جنسیت برای پرورش پرندگان در اسارت و مطالعات تکاملی ضروری است. روش‌هایی با درجات مختلف تهاجمی مانند تعیین جنسیت دریچه، جراحی لاپاروسکوپی، تعیین جنسیت استروئیدی و بازرسی کروموزوم (کاریوتایپینگ) برای شناسایی جنسیت در پرندگان تک‌مورفیک استفاده می‌شود.

تعیین جنسیت پرندگان زینتی به روش PCR در اصفهان

این پروتکل به شما امکان می دهد با تقویت ناحیه ای از ژن های CHD1-Z و CHD1-W بر روی کروموزوم های جنسی Z و W، جنسیت پرنده را آزمایش کنید، با استفاده از کالاموس پر (پایه پر) پرهای کنده شده به عنوان یک منبع DNA

برای اکثر پرندگان، مناطق ژنی تکثیر شده از هر کروموزوم دارای طول متفاوتی خواهد بود، که منجر به یک آمپلیکون تک طول (رشته تکثیر شده DNA) برای پرندگان نر (با کروموزوم ZZ) و دو آمپلیکون با طول متفاوت برای پرندگان ماده (کروموزوم ZW) می شود. . شما می توانید این آمپلیکون ها را روی یک ژل الکتروفورز برای تعیین جنسیت پرنده تجسم کنید – یک نوار برای نرها و دو باند برای ماده. دو مجموعه پرایمر در این پروتکل گنجانده شده است زیرا در حال حاضر هیچ مجموعه پرایمر واحدی وجود ندارد که برای همه گونه های پرنده موثر باشد. دو مجموعه پرایمر (CHD1F/CHD1R و 2550F/2718R) باید امکان تمایز جنسیت را برای اکثر پرندگان فراهم کند. با این حال، برخی از گروه های پرندگان نمی توانند با استفاده از این روش ها به طور قابل اعتماد جنسیت شوند.

ژنتیک پرندگان زینتی چگونه است؟

این پروژه متکی است که طول DNA تقویت شده بین کروموزوم‌های جنسی W و Z پرنده متفاوت است.

 

کروموزوم های جنسی پرنده W و Z

این آزمایش ژن‌های CHD1 (Chromodomain Helicase DNA Binding Protein 1) را هدف قرار می‌دهد که در کروموزوم‌های جنسی W و Z پرندگان به‌عنوان دو گونه وجود دارد – CHD1-W (روی کروموزوم W اختصاصی ماده) و CHD1-Z (موجود در نر و ماده در کروموزوم Z). این ژن‌ها همولوگ هستند (تقریباً از نظر ساختار و عملکرد یکسان) اما حاوی اینترون‌ها هستند (DNA که قبل از تبدیل شدن به RNA بالغ توسط پیوند RNA حذف می‌شود) که معمولاً از نظر طول بین جنس‌های موجود در یک گونه و بین گونه‌ها متفاوت است.

نتایج ممکن برای آزمایش تعیین جنسیت پرندگان چیست؟

دو نتیجه ممکن برای اکثر پرندگان وجود دارد:
زن: یک نسخه از ژن CHD1-Z در کروموزوم Z و یک نسخه از ژن CHD1-W در کروموزوم W وجود دارد. مناطق تقویت شده هدف این ژن ها عموماً از نظر طول متفاوت هستند و روی ژل الکتروفورز به صورت دو نوار مجزا قابل مشاهده خواهند بود.
مرد: دو نسخه از ژن CHD1-Z وجود دارد – یکی در هر یک از کروموزوم های Z. نواحی تقویت شده این ژن ها تقریباً همیشه از نظر طول یکسان هستند و روی ژل الکتروفورز به صورت یک نوار قابل مشاهده خواهند بود.
استثناهایی برای این نتایج ممکن است رخ دهد و در زیر به تفصیل شرح داده شده است.

مثبت کاذب (تشخیص نر به عنوان زن)

الف) آلودگی ناشی از محصولات PCR پرنده ماده قبلاً تقویت شده روی پیپتتورها، محلول‌ها، محیط‌های کاری، لوله‌ها یا قلم ممکن است منجر به مثبت کاذب شود. هر گونه آمپلیکون تولید شده توسط کنترل منفی نشانه آلودگی بالقوه است. برای جلوگیری از آلودگی باید یک روش خوب آزمایشگاهی PCR انجام شود. برای اطلاعات بیشتر به منبع “عمل خوب PCR آزمایشگاهی” مراجعه کنید.
ب) به ندرت یک پرنده نر ممکن است دو گونه متفاوت از ژن CHD1-Z را در کروموزوم های Z خود داشته باشد (پلی مورفیسم آلل Z) که می تواند به صورت دو نوار نشان داده شود (داوسون و همکاران 2001). حتی به ندرت دو نوع مختلف می توانند یک مولکول هترودپلکس را تشکیل دهند (دو رشته تک رشته ناهمخوان DNA که در یک مولکول دو رشته ای به هم متصل شده اند)، در نتیجه یک مولکول هیبریدی ایجاد می شود که آهسته تر از حد انتظار در ژل مهاجرت می کند (کیسی و همکاران 2009). .

منفی کاذب (تشخیص زن به عنوان مرد)

 

الف) آلودگی حاصل از محصولات PCR که قبلاً از نمونه های پرنده نر تقویت شده است ممکن است منجر به منفی کاذب شود (به بخش موارد مثبت کاذب در بالا مراجعه کنید).
ب) برخی از گونه های پرنده ممکن است اینترون های با اندازه بسیار مشابه در نواحی ژن CHD1-Z و CHD1-W هدف داشته باشند. بنابراین، نمونه‌های این پرندگان دو آمپلیکون با اندازه بسیار مشابه برای هر دو منطقه تولید می‌کنند که حتی اگر پرنده ماده باشد، ممکن است به صورت یک نوار قابل مشاهده باشند.
ج) ممکن است پرایمرها برای یکی از مناطق ژنی هدف در ماده ها مناسب نباشند، به عنوان مثال. در برخی از پرندگان Passerine با استفاده از پرایمرهای 2550F/2718R (Fridolfsson & Ellegren 1999)، یا برخی Psittaciformes با استفاده از آغازگرهای CHD1F/CHD1R (Çakmak et al. 2017).
د) آمپلیکون‌های کوتاه‌تر ممکن است ترجیحاً تقویت شوند و در نتیجه تنها یک باند در هنگام اجرا روی ژل الکتروفورز قابل مشاهده باشد. با این حال، اگر اندازه آمپلیکون‌های مورد انتظار هنگام استفاده از پرایمرهای CHD1F/CHD1R و 2550F/2718R مشخص باشد، ممکن است همچنان بتوان نتایج تک باند را به‌عنوان ماده شناسایی کرد، زیرا ناحیه CHD1-W مخصوص زنانه کوچک‌تر از CHD1 مشترک است. منطقه Z.
به دلیل پتانسیل نتایج منفی کاذب و نتایج مثبت (به ویژه ماده‌ها که به عنوان نر شناخته می‌شوند)، توصیه می‌کنیم ادبیات منتشر شده را بررسی کنید تا مشخص شود آیا کسی قبلاً از ناحیه CHD1 برای تعیین جنسیت گونه‌های پرنده مورد علاقه استفاده کرده است یا خیر. چه پرایمرهایی برای آن گونه بهتر عمل کردند. و طول آمپلیکون مورد انتظار برای مردان و زنان.

پروتکل تعیین جنسیت پرندگان زینتی

در این پروژه ابتدا DNA را از پرهای کنده شده استخراج خواهید کرد. این حدود 20 دقیقه طول خواهد کشید. پس از این، از PCR برای تقویت مناطق ژنی CHD1-Z و CHD1-W استفاده خواهید کرد. این حدود 3 ساعت طول می کشد، اما بیشتر آن زمان انتظار خواهد بود. در نهایت، نتایج را با استفاده از ژل الکتروفورز تجسم خواهید کرد که حدود 1 ساعت طول می کشد.
در پایان هر بخش، می توانید بلافاصله ادامه دهید، یا نمونه های خود را ذخیره کنید و بعدا ادامه دهید.
استخراج DNA
ابتدا نمونه DNA را با استفاده از پروتکل DNA Extraction from Feathers بدست آورید. حدود 20 دقیقه طول می کشد، در پایان آن باید یک نمونه الگوی DNA تمیز در یک لوله PCR داشته باشید.
PCR
شما به استخراج DNA خود (1)، یک لوله PCR خالی (2)، یک لوله میکرو سانتریفیوژ خالی 1.5 میلی لیتری، مخلوط پرایمر برای این پروژه (3)، مخلوط اصلی Firepol (4)، و آب درجه PCR (5) نیاز دارید.
اولین قدم این است که محاسبه کنید چه مقدار مخلوط واکنش PCR برای نمونه های خود نیاز دارید.
مخلوط واکنش PCR ترکیبی از مخلوط اصلی Firepol، مخلوط پرایمر و آب درجه PCR است که قبل از افزودن استخراج DNA به هر لوله PCR اضافه می‌کنید.
برای هر نمونه، شما نیاز دارید:
4 میکرولیتر مخلوط اصلی Firepol
10 میکرولیتر آب درجه PCR
2 میکرولیتر مخلوط پرایمر
4 میکرولیتر الگوی DNA
شما همچنین به یک کنترل منفی نیاز دارید.
یک کنترل منفی یک لوله PCR از مخلوط واکنش PCR است که شما DNA را به آن اضافه نمی کنید. این برای بررسی اینکه مخلوط واکنش PCR شما آلوده نیست استفاده می شود.
اگر چندین واکنش را با استفاده از پرایمرهای یکسان انجام می دهید، ابتدا می توانید یک مخلوط واکنش حاوی همه معرف های مشترک ایجاد کنید. این به معنای پیپت کمتر است و شما از نوک پیپت کمتری استفاده خواهید کرد.
برای محاسبه مقدار هر معرف مورد نیاز:
[تعداد استخراج DNA] + [کنترل منفی] + 10٪
به عنوان مثال، اگر 9 نمونه از استخراج DNA خود دارید:
9 استخراج DNA + 1 کنترل منفی + 10% = 11 تکرار معرف PCR
11 x 4 µL = 44 µL مخلوط اصلی Firepol
11 x 10 µL = 110 µL آب درجه PCR
11 x 2 µL = 22 µL مخلوط پرایمر
در این مثال، از پیپت قابل تنظیم 20-200 میکرولیتری برای انتقال 44 میکرولیتر از مخلوط اصلی Firepol، 110 میکرولیتر آب درجه PCR و 22 میکرولیتر مخلوط پرایمر به یک لوله میکرو سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری استفاده می کنید. حتماً هر بار از یک پیپت تازه استفاده کنید.
درب لوله میکروسانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری را ببندید و چندین بار معکوس کنید تا از مخلوط شدن کامل مخلوط واکنش PCR خود مطمئن شوید.
اگر از مخلوط واکنش PCR استفاده می کنید، پیپت 2-20 میکرولیتری قابل تنظیم را روی 16 میکرولیتر تنظیم کنید و 16 میکرولیتر از مخلوط واکنش PCR را به تعداد مورد نیاز لوله PCR منتقل کنید.
اگر از مخلوط واکنش PCR استفاده نمی کنید، از یک پیپت 2-20 میکرولیتری قابل تنظیم برای افزودن هر مورد (4 میکرولیتر از مخلوط اصلی Firepol، 10 میکرولیتر آب درجه PCR و 2 میکرولیتر مخلوط پرایمر) به صورت جداگانه به لوله PCR استفاده کنید.
از یک نشانگر دائمی برای برچسب زدن لوله های PCR با نام نمونه خود استفاده کنید. کنترل منفی را نیز برچسب بزنید تا بدانید که DNA را به این لوله PCR اضافه نکنید.
اکنون استخراج DNA را اضافه کنید. میکروپیپت خود را روی 4 میکرولیتر تنظیم کنید.
با استفاده از نوک پیپت تازه، 4 میکرولیتر از استخراج DNA خود را به لوله PCR نشاندار شده حاوی مخلوط واکنش PCR منتقل کنید. سپس نوک خود را دور بریزید.
اطمینان حاصل کنید که استخراج DNA خود را به صورت عمودی نگه دارید و از سطح مایع پیپت کنید.
استخراج DNA حاوی بازدارنده های PCR است که در صورت مخلوط شدن مایع از موفقیت آمیز بودن PCR شما جلوگیری می کند.
هنگامی که استخراج DNA را به لوله PCR پیپت کردید، درب آن را ببندید و لوله را چندین بار معکوس کنید تا مطمئن شوید که DNA در مخلوط واکنش PCR مخلوط شده است.
لوله PCR را محکم روی یک سطح سخت ضربه بزنید تا مایع در پایین جمع شود و مطمئن شوید که حباب های هوا در مایع وجود ندارد.
لوله های PCR خود را در بلوک ترموسایکلر قرار دهید.
ترموسایکلر را با برنامه PCR زیر راه اندازی کنید:
در این مرحله از PCR برای تقویت نواحی ژنی CHD1-Z و CHD1-W با طول های متغیر استفاده خواهید کرد. شما می توانید از بین دو مجموعه پرایمر انتخاب کنید: CHD1F/CHD1R یا 2550F/2718R.
(برای راهنمایی در مورد راه‌اندازی تاچ داون PCR در آزمایشگاه بنتو، به راهنمای کاربر PCR Thermocycler مراجعه کنید.)
پرایمرهای CHD1F/CHD1R
5 دقیقه در 95 درجه سانتی گراد
9 چرخه ساخته شده از 3 مرحله:
30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد
45 ثانیه در دمای 57-50 درجه سانتی گراد (تاچ داون)
45 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد
26 چرخه ساخته شده از 3 مرحله
30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد
45 ثانیه در 50 درجه سانتی گراد
45 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد
5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد
پرایمرهای 2550F/2718R
5 دقیقه در 95 درجه سانتی گراد
11 چرخه ساخته شده از 3 مرحله:
30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد
30 ثانیه در 60-51 درجه سانتیگراد (تاچ داون)
30 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد
24 چرخه ساخته شده از 3 مرحله
30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد
30 ثانیه در 50 درجه سانتی گراد
30 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد
5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد
اگر برای کار با ترموسایکلر Bento Lab به کمک نیاز دارید، دفترچه راهنما را بررسی کنید. می توانید از پیش تنظیم PCR (1) استفاده کنید، سپس (2) برنامه را به تنظیمات مورد نیاز (3) تغییر دهید قبل از اجرای برنامه (4).
این برنامه حدوداً 2 ساعت اجرا خواهد شد. وقتی تمام شد، می توانید نتیجه را در فریزر نگه دارید یا بلافاصله برای الکتروفورز ژل از آن استفاده کنید.
الکتروفورز ژل
پروتکل الکتروفورز ژل را دنبال کنید تا یک ژل ریخته شود و آن را با نتیجه PCR خود و یک نردبان 100 جفت باز اجرا کنید. این باید حدود 1 ساعت طول بکشد.
تجسم ژل
پس از اتمام اجرای ژل، می توانید نتایج خود را تجسم کنید.
همانطور که ژل را کنترل می کنید، به پوشیدن دستکش ادامه دهید.
درب نارنجی جعبه ژل را باز کنید و چگالش را پاک کنید.
بافر را به آرامی بیرون بریزید و بافر را در زهکشی بریزید.
دفع تخلیه بافرهای در حال اجرا TBE یک روش استاندارد دفع زباله است که توسط آزمایشگاه های تحقیقاتی دنبال می شود. اگر سوالی دارید، با ما در تماس باشید.
جعبه ژل را روی سطح ترانسیلمیناتور Bento Lab قرار دهید. برای اینکه بهترین دید را داشته باشید، باید این کار را در اتاقی تا حد امکان تاریک انجام دهید.
Bento Lab را روشن کنید، ماژول ژل الکتروفورزیس را انتخاب کنید و چراغ Transilluminator را روشن کنید.
درب فیلتر نارنجی را روی ژل نگه دارید تا نوارهای DNA را تجسم کنید. برای مستندات، از تلفن همراه خود برای گرفتن عکس واضح از ژل استفاده کنید. به جای نگه داشتن درب روی ژل، می توانید درب را مستقیماً جلوی لنز دوربین خود بگیرید.
اگر نوارها کمرنگ هستند، سعی کنید نور اتاق را کاهش دهید، به عنوان مثال. با بستن پرده ها و خاموش کردن چراغ ها. همچنین می توانید ژل را با احتیاط از جعبه ژل خارج کرده و مستقیماً روی ترانس ایلومیناتور قرار دهید. هنگام انجام این کار دستکش بپوشید و مراقب باشید که ژل نشکند.
تجزیه و تحلیل نتایج شما در تشخیص جنسیت پرنده
تصویر ژل خود را با این نتیجه مثال مقایسه کنید که با همه تغییرات اجرا شده است. نمونه شما باید با یکی از این تغییرات مطابقت داشته باشد.
1 – نردبان – نردبان DNA 100 جفت باز
2 – DNA جوجه ماده با استفاده از پرایمرهای CHD1F/CHD1R – دو باند مجزا: یکی در ~320bp و دیگری در ~500bp.
3 – DNA مرغ نر با استفاده از پرایمرهای CHD1F/CHD1R – یک باند در ~500 جفت باز.
4 – DNA جوجه ماده با استفاده از پرایمرهای 2550F/2718R – دو باند مجزا: یکی در ~500bp و دیگری در~700bp.
5 – DNA مرغ نر با استفاده از پرایمرهای 2550F/2718R – یک باند در ~700 جفت باز.
نتایج شما – با هر مجموعه پرایمر، دو باند نشان می دهد که DNA از پرنده ماده است و یک نوار نشان می دهد که DNA از پرنده نر است.
بعد از اینکه عکس های خوبی از ژل برای مستندات خود گرفتید، می توانید ژل را در سطل زباله معمولی خود دور بریزید.
دفع ژل آگارز یک روش استاندارد دفع زباله است که توسط آزمایشگاه‌های تحقیقاتی دنبال می‌شود. اگر سوالی دارید، با ما در تماس باشید.